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1. 서론

최근 10여년 동안 공기를 매개로 하는 미생물에 의한 감염성 질병이 세계적으로 수차례 유행 하였다. SARS(Severe Acute Respiratory Syndrome) 는 2002년 11월에서 2003년 7월까지 유행하여 8,098명의 감염자를 발생시키고 774명을 사망에 이르게 한 것으로 보고되었다. 2009년 세계적으로 유행하면서 100여개 국가에서 800명 이상의 사망자가 보고된 신종 인플루엔자 A(Influenza A virus subtype H1N1) 전파를 계기로 공기감염에 대한 관심이 급속하게 증가하였다. 세계보건 기구(World Health Organization: WHO)에 따르면, 최근 발병한 신종 인플루엔자 바이러스의 경우 신형 바이러스로 2010년 3월 12일 까지 전 세계 213개국에서 감염자가 확인되었으며 사망자가 16,713명으로 공식 집계되었다(Kwon and Kim, 2010). 이로 인해 공기를 통해 전달되는 감염에 대한 인식과 관심이 크게 증가하였고, 관련 연구의 필요성이 증대되었다. 

공기 감염에 관한 연구는 크게 공기를 통해 전달되는 감염 물질의 전달 메커니즘을 수치해석적으로 밝히는 연구와 이를 통해 밝혀진 감염 물질의 전파 경로를 토대로 감염 확률을 추정하는 연구로 나눌 수 있다. 공기 감염을 통한 감염 물질의 전달 메커니즘을 밝히는 연구 분야의 결과는 꾸준히 증가하고 있다(Chao and Wan, 2006; Li et al., 2007; Nicas et al., 2005). 또한 이러한 연구는 비행기, 거주환경, 사무실, 빌딩, 병원 등 다양한 적용분야에 대해 연구되고 있다(Chow and Yang, 2005; Richmond-Bryant, 2009; He et al., 2011). 감염 확률을 추정하는 연구의 경우, Sze To et al.(2008)은 기존의 Dose-response 모델을 개량하여 공기를 통한 감염 확률을 예측하는 방법을 제시하였다. 이는 확률론적인 모델로써 공간내의 유동을 고려한 시간과 공간에 따른 감염 확률 평가 방법이다. Dose-re- sponse 방법은 기존의 방법들보다 많은 변수를 고려하여 복잡한 현상을 좀 더 정확하게 예측 할 수 있기 때문에 관련 연구가 증가하고 있다. Dose-response 방법을 이용하기 위해서는 공기 중에 부유하는 감염 물질의 시간에 따른 생명성(viability) 변화에 대한 정보의 필요성이 제기 되었다. 이는 공기 중으로 전달되는 감염 물질의 정확한 양을 예측하기 위해서는 물리적인 거동뿐만 아니라 생물학적으로 시간에 따라 미생물이 자연적으로 감소하는 양도 예상하여 적용해야 하기 때문이다. 

필자는 Lee and Hwang(2012) 논문에서 위에 언급한 공기 감염에 관한 두 가지 연구를 통합 하여 연구하였다. 수치해석적 기법을 이용하여 감염 물질의 전달 메커니즘을 밝히고 이를 토대로 Dose-response 모델을 적용하여 감염 확률을 구하는 연구를 진행하였다. 이 과정에서 시간에 따른 생명성 변화 정보를 감염확률 계산에 필요한 입력값으로 사용하였는데, 사용된 생명성 변화 정보는 실험적으로 구했던 값이었다. 본 본문에서는 당시 사용했던 실험적 방법을 설명하고자 한다. 

공기 중에 부유하는 박테리아나 바이러스의 생명성을 측정하는 것은 실험적으로 두 가지 제한점을 갖는다. 실험 대상이 되는 박테리아나 바이러스가 갖고 있는 감염성 때문에 실험군을 선택하는 데에 제한적일 수밖에 없다는 점과 공기 중에 부유하는 실험 대상을 정확하게 포집하기가 어렵다는 것이다. 첫 번째 제한점을 해결하기 위해 인체에 유해성이 적다고 알려져 많은 미생물 관련 실험에서 널리 쓰이고 있는 Escherichia coli (KCCM 12119, ATCC 11775)를 사용하였다. 물론 각각의 박테리아가 갖고 있는 고유의 생명성은 다를 수 있지만, 대부분의 실험에 사용되는 E. coli를 사용함으로써 박테리아들이 갖고 있는 생명성의 경향성을 판단한다는데에 대해서 의미를 지니고 있다. 지금까지 연구자들 역시 이러한 문제에 동의하고 있다 (Benbough, 1967; Cox, 1966; Marthi et al., 1990). 두 번째 제한점을 해결하기 위해서 공기 중에 부유하는 박테리아의 초기 농도와 생명성 변화를 효과적으로 측정할 수 있는 실험 방식을 제안하려 한다. 본 연구에서는 공기 중에 부유하는 E.coli를 대상으로 시간에 따른 생명성을 변 화에 대해 실험적으로 밝히고 고찰하려고 한다. 본 연구에서는 또한 상온상압에서의 공기 중에 배출된 감염 물질의 시간에 따른 생명성 변화를 측정할 수 있는 실험 방법을 제안하고 실험 결과를 관련 연구에 적용될 수 있는 기초 자료로 제시하려 한다. 

2. 생명성 함수

공기 중에 노출된 박테리아는 여러 요인에 의해서 시간이 지남에 따라 사멸하게 된다. 이를 확률로 나타낸 것을 생명성(viability)이라고 정의한다. 이는 실험적인 방법을 통해 산출할 수 있다. Eqn.1과 같이, 본 연구에서는 Sze To et al.(2008)의 실험에 이용된 감염 입자의 생명성 함수(viability function, f(t))를 사용하였다. 

C_b 는 배양된 바이오에어로졸의 농도(culturable bioaerosol concentration)를 의미하고, C_t 는 총 바이오에어로졸 농도(total bioaerosol concentration) 를 의미한다. 밑 첨자 r은 실험 전 공기 중에 존재하는 해당 기준 농도(reference concentration)를 의미한다. 분자의 값들은 바이오에어로졸의 농도(CFU/m³)로 sixth stage viable Anderson impactor (TE-10-800, Tisch Environmental Inc., USA) 를 이용하여 측정한다. 분모의 값들은 총 바이오에어로졸의 농도(#/m³)로 공기역학적 입자계 수기 (Aerodynamic particle sizer, APS, TSI model 3321)를 이용하여 계측하였다. 공기역학적 입자 계수기는 광학 원리로 입경별 입자의 개수 농도나 질량 농도 등을 측정하는 장비이다. 

3. 실험

3.1 실험용 박테리아 용액 준비

본 실험에서는 Escherichia coli (KCCM 12119, ATCC 11775)를 대상으로 실험을 수행하였다. E.coli의 크기 분포는 대략 1μm(Fig.1 참조)로폐의 침착될 확률이 있는 바이오에어로졸에 관심을 갖고 있는 본 연구의 조건에 부합한다. 다음은 E.coli 용액의 준비 과정을 보여준다. 증류수 1L에 액체 영양배지(Nutrient broth) 8g를 현탁(suspension)하여 배양액을 만든 후 멸균기 (Autoclave; Model DS-AC60, DASOL Hitec., KOREA)에서 120°C의 온도로 20분간 고온고압 의 멸균처리를 하였다. 멸균된 배양액에 E.coli를 주입하고 진탕배양기 (Shaking incubactor)로 37°C에서 24시간 동안 배양하였다. 배양된 미생물 용액은 분광광도계(SP-300, Optima)를 사용하여 600nm 파장에서 미생물 현탁액의 광학밀도 (O.D. ; optical density)값을 0.1로 희석하였고, 이를 다시 1/1000로 희석하여 약 1.35×10⁵cells/ml의 농도를 갖는 E.coli 용액을 사용하였다. 위 방법으로 제작된 E.coli 용액은 미립화기에 들어가서 실험에 사용된다. E.coli의 초기 농도는 1.35×10⁵cells/ml이다. 

Fig. 1. Experimental Schematics.

3.2 실험 방법

실험장치의 구성은 Fig.1과 같다. 실험 장치는 크게 바이오에어로졸 발생 장치, 실험용 덕트, 계측용 분석 장비로 구성된다. 실험에 사용된 공기는 헤파(HEPA; high efficiency particulate air) 필터가 내장되어 있는 청정공기 공급 장치(clean air supply system)를 통과한 청정공기를 사용하였다. 공급된 청정공기는 질량 유량계에 의해 2L/min의 유량으로 미립화기(Atomizer; model 9302, TSI Inc., USA)로 유입되어 바이오 에어로졸을 발생시킨다. Fig.2에서 볼 수 있듯이 이러한 미립화기에는 앞에서 설명한 시험용 E.coli 용액이 들어가게되며 압축공기가 용기에 유입되면 용액은 orifice을 지나면서 속도는 빨라지게 되고, 압력이 낮아지면서 E.coli가 공기에 더불어 분사된다. 발생된 바이오에어로졸은 확산건조기(diffusion dryer)를 이용해 수분을 제거하고, 중화기(Aerosol neutralizer; Soft X-ray charger 4530, HCT Co., Ltd., Korea)를 이용하여 볼츠만 분포 하전량을 띄게 한다. 이와 같은 방법으로 발생된 바이오에어로졸은 실험 덕트로 유입된다. 

Eqn.2는 덕트 내부에서의 바이오에어로졸의 종말 속도(terminal velocity)로 중력 침강에 의한 속도와 유동에 의해 발생하는 속도의 합으로 이루어져 있다. ρ_p 는 바이오에어로졸의 밀도, d_p 는 바이오에어로졸의 직경, g는 중력 가속도, V_f 는 덕트 내부의 면 유속을 의미한다. 위 식을 통해 이론적으로 추정된 바이오에어로졸의 종말 속도와 질량 유량계에서 제어 가능한 한계 유량 등의 정보를 바탕으로 실험 장치를 구성 하였다. 또한 미립화기(atomizer)에서 발생된 바이오에어로졸이 덕트로 유입되는데 소요되는 시간과 바이오에어로졸이 덕트에서 측정 장비까지 도달하는 데 소요되는 시간을 고려하여 반영하였다. 이론적인 계산을 바탕으로 추정한 덕트 내부에서의 바이오에어로졸의 속도는 0.165cm/s로, 매 분 약 10cm를 이동한다. 

실험 덕트는 아크릴로 제작되었으며, 직경 140mm의 원형 덕트를 사용하였고 덕트를 수직 방향으로 설치하여 실험을 진행하였다. 덕트에 부착된 측정 프로브의 직경은 12.7mm이다. 측정 브로브의 위치(H)는 실험 조건에 따라 덕트의 유동 유입구로부터 0.1~1.5m까지 이동하며 실험을 진행하였다.

실험 덕트 후단에 두 계측장비를 설치하였다. sixth stage viable Anderson impactor (TE-10-800, Tisch Environmental Inc., USA) 장비는 공기 중에 바이오에어로졸을 포집하여 이후 배양 과정을 통해 생명성을 가진 바이오에어로졸의 농도를 측정하기 위해 사용하었다. 이 때 영양배지를 포집 기판에 올려 실험을 하였다. 다음은 바이오에어로졸 포집용 고체 영양배지의 제작 방법이다. 증류수 1L에 고체 영양배지(Nutrient agar) 23g를 현탁(suspension)하여 배양액을 만든 후 멸균기에서 120°C의 온도로 20분간 고온고압의 멸균처리를 하였다. 페트리 접시(Petri dish)위에 마이크로피펫을 이용하여 혼합액 15ml을 살포한 후 고르게 분포되도록 스프레더 (Spreader)를 사용하여 도말하였다. 

공기역학적 입자계수기 (Aerodynamic particle sizer, APS, TSI model 3321)는 덕트 후단에서 검출되는 모든 입자의 농도를 측정하는데 사용하였다. 덕트 후단에서 검출되는 모든 입자에는 살아있거나 생명성을 잃는 바이오에어로졸 모두가 포함된다. 공기역학적 입자계수기의 경우에는 샘플링 유량이 1L/min이고 sixth stage via- ble Anderson impactor의 경우에는 샘플링 유량이 28.3L/min이다. 덕트에서 계측 장비로 유입 되는 유량은 0.5L/min이다. Fig.1에서 볼 수 있듯이 모자란 샘플링 유량의 경우 헤파 필터를 거친 외부 공기를 펌프를 통해 유입시켰다. 헤파 필터 후단에 질량 유량계를 설치하여 측정 장비로 유입되는 공기의 양을 조절하였다. 

본 연구의 실험 온도와 습도 조건은 각각 21±2°C, 상대습도 40±5%이다. 실험은 수 분간 청정공기 (clean air)만을 흘려준 후 바이오에어로졸을 발생하지 않은 상태에서 덕트 내부의 총 입자(С_t,r)와 바이오에어로졸 기준 농도 (C_b,r)를 측정한 후 매 분에 해당하는 위치의 측정 프로브를 이동하면서 총 입자(C_t) 농도와 바이오에어로졸의 농도(C_b)를 측정하는 방식으로 1~15분에 걸쳐 매분마다 실험을 실시하였다. 

Fig. 2. Schematics of atomizer.

4. 결과 및 고찰

본 논문에서는 각 시간 간격에 대한 생명성 실험은 5번씩 수행하였고, 이 값의 평균과 표준편차를 실험 결과로 사용하였다. 

Fig.3은 실험을 수행하기 전에 측정한 전체 입자와 바이오에어로졸의 기준 수 농도를 나타 낸다. 전체 입자 수의 경우 시간이 따라 약간 감소하는 경향을 보이지만 큰 차이는 보이지 않았다. 바이오에어로졸의 수 농도 역시 시간에 따른 변화가 거의 없었다. 새로운 조건의 실험을 하기 전에 충분한 시간동안 청정 공기를 공급하여 기존에 존재하던 공기를 치환시켜 주어 기준 농도 측정 결과는 시간에 따라 큰 차이를 보이지 않았다. 

Fig.4는 시간에 따라 측정된 총 바이오에어로졸 농도(total bioaerosol concentration)와 배양된 바이오에어로졸 농도(culturable bioaerosol con-centration) 값이다. 이 결과는 기준 농도 값을 감한 값이다. 총 바이오에어로졸의 수 농도의 경우 시간에 따라 줄어드는 경향을 보이지만 감소량이 크지 않다. 시간이 지남에 따라 늘어 나는 덕트 길이와 실험 시간을 고려한다면 이는 덕트 벽면 손실로 인해 총 입자 수 농도가 시간에 따라 미세하게 줄어든 것으로 판단된다. 배양된 바이오에어로졸의 수 농도의 경우 시간에 따라 지속적으로 감소하는 것을 확인할 수 있다. Cox(1966)의 논문에서 역시 E.coli의 생명성의 지수 형태로 감소하는 것을 확인할 수 있다. Anderson impactor로 측정된 후 배양된 수농도는 발생 직후 바이오에어로졸 수농도에 비해서 낮은 값으로 나타났다. 바이오에어로졸의 발생 직후 농도는 2.37×10¹⁰#/m³이고, Anderson im- pactor로 측정된 후 배양된 총 입자 수농도의 평균값은 약 6×10⁸#/m³으로 나타났다. 

Fig.5는 시간에 따른 바이오에어로졸의 생명성을 나타낸다. 발생 1분 후 바이오에어로졸의 생존 확률은 24.5%이다. 나머지 75%의 감소량은 1분 이내에 사멸된 바이오에어로졸과 측정 과정에서 손실된 바이오에어로졸 모두를 포함하고 있다. 15분 동안 바이오에어로졸의 생명성은 지속적으로 감소하게되고 15분이 지난 후에는 3.9%의 바이오에어로졸만이 생존하는 것으로 나타났다. 15분 동안 바이오에어로졸의 생명성 함수는 y(%) = 28.454e^-0.132x (x:시간, 분)으로 판명되었는데 이는 Cox(1966)의 연구 결과와 유사하다. Cox(1966)는 50% 습도 조건에 따른 공기 중 생명성 결과를 발표하였다. Cox(1966)에 따르면 시간에 따른 바이오에어로졸 생명성 함수는 y(%) = 34.397e^-0.114x (x:시간, 분)이다. Cox(1966)의 실험 결과에 따르면 15분 동안 30.7%에서 1.3%로 29.4%가 줄어들었다.본 연구 결과가 Cox(1966)의 결과보다 시간에 따른 생명성 변화율이 작지만 대체적으로 유사한 경향성을 보인다.

발생 직후의 바이오에어로졸 농도와 배양 방법으로 측정된 바이오에어로졸의 농도 간의 차이는 크게 두 가지 원인으로 설명할 수 있다. 첫 번째 원인으로 발생 후 바이오에어로졸은 상호간의 충돌에 의해서 응집현상을 일으키고 이는 수 농도 감소의 원인으로 작용했다고 판단할 수 있다. 두 번째 원인은 공기의 독성으로 인한 영향이다. Benbough(1967)는 본 실험과 비 슷한 조건 하에서 공기 독성이 바이오에어로졸에 미치는 영향에 대한 결과를 밝혔다. 실험 대상은 본 실험과 같은 E.coli이며, 순수 질소 (>99.9%) 환경과 일반 청정 공기 환경에서 실험을 진행하여 두 결과를 비교하였다. 질소의 경 우 반응성이 매우 작기 때문에 실험 대조군으 로 적합하다. Benbough(1967)의 실험 결과, 순수 질소 환경에서는 바이오에어로졸 발생 30분 후 생명성이 76%인 반면에, 일반 청정 공기 환경 에서는 1.1%로 큰 차이를 보였다. 이는 공기의 독성이 바이오에어로졸의 생존에 큰 영향을 미치는 것으로 판단할 수 있다. 

또한 실험적인 오차로 인하여 E.coli의 생명성 변화의 영향을 준다. 바이오에어로졸의 수 농도 측정 과정 중에 계측장비의 큰 측정 유량으로 인해 발생된 손실을 들 수 있다. Anderson im- pactor는 측정을 위해 28.3l/min의 큰 유량을 요구한다. 이러한 과정에서 바이오에어로졸은 빠른 속도로 측정 용기에 부딪히게 되고 많은 손실이 발생한다(Stewart et al., 1995). 

Fig. 3. Number of reference values versus time.

Fig. 4. Number of total particles and culturable bioaerosol versus time.

Fig. 5. Bioaerosol viability function versus time.

5. 결론

본 연구에서는 E.coli을 대상으로 생명성 변화를 측정하기 위해 수직 덕트 위치에 박테리아를 체류시켜 공기역학적 입자계수기와 Anderson impactor를 이용하여 실험적으로 밝혔다. 15분 동안 바이오에어로졸의 생명성은 지속적으로 감소하게 되고 15분이 지난 후에는 3.9%의 바 이오에어로졸만이 생존하는 것으로 나타났다. 15분 동안 바이오에어로졸의 생명성 함수는 y(%) = 28.454e^-0.132x (x:시간, 분)으로 시간에 따라 감소하는 경향을 보였다. 생명성 함수가 위와 같은 함수의 형태로 감소하는 원인은 크게 두 가지로 설명할 수 있다. 하나는 발생된 바이오에어로졸이 상호간의 충돌에 의해서 응집되면서 전체 수 농도가 감소하였다는 점과 또 다른 원인은 공기의 독성으로 인한 영향이다. 이 연구 결과는 공기 중의 노출된 박테리아가 시간이 지남에 따라 생명성을 잃는 과정을 시간에 따른 함수로 밝혀냄으로써 이후 공기 중 바 이오에어로졸에 의한 감염 확률 계산 연구에 있어서 중요한 근거 자료로써 가치가 있을 것으로 기대된다. 

하지만, 본 논문의 생명성 연구 결과는 몇 가지 한계점을 지닌다. 첫째로는 E.coli 단일 종에 대해 공기 중에서의 생명성을 밝혔기 때문에 이 결과를 모든 박테리아 종에 대한 생명성 결과로 확대하기 어렵다. 모든 박테리아 종에 대한 공기 중 생명성을 언급하기 위해서는 이후 다른 종의 박테리아에 대한 생명성 결과가 보고되어야 할 것이다. 둘째로 E.coli가 미립화기,확산건조기 그리고 임팩터 등의 실험 장치를 통과하면서 발생하는 충격에 의해 생명성에 타격을 입게 된다. 이는 시간에 따른 생명성 함수 를 밝히는데 실험적인 오차로 작용한다. 앞으로의 연구에서는 실험상의 충격으로 인한 생명성 오차를 줄여나가고 또한 이러한 오차들을 반영하여 좀 더 정확한 생명성 함수를 예측할 수 있는 방법들을 모색해야 할 것이다. 

감사의 글

본 연구는 한국환경산업기술원 (KEITI) 차세대에코이노베이션사업 (과제번호: 402-111-005) 의 연구비 지원에 의해 수행되었습니다.